引言
果蠅是遺傳學(xué)科研和教學(xué)中被普遍使用的生物,因為它具有染色體少、已定位基因數(shù)多,突變性狀多的優(yōu)點,因此,它是研究基因分離、連鎖交換、基因表達與調(diào)節(jié)的理想材料。提取果蠅DNA并對其特定的基因片段擴增是多個實驗項目中必要步驟,被廣泛應(yīng)用于各種基礎(chǔ)性或開放性的遺傳學(xué)實驗課程。
提取DNA的質(zhì)量直接影響后續(xù)PCR擴增、限制性酶切以及基因測序的實驗效果。采用常規(guī)昆蟲DNA的提取方法去提取果蠅的DNA不僅耗時長、成本高,而且提取的效果不穩(wěn)定,不適合本科的實驗教學(xué)。南開大學(xué)遺傳學(xué)實驗課程組將常用的動物組織DNA提取方法改造后用于實驗教學(xué),建立了一種高效地提取果蠅DNA的新方法,取得了良好的教學(xué)效果。
實驗過程
材料:實驗中采用的果蠅攜帶有YAP基因
提取方法:
(1)常規(guī)方法一:將兩支果蠅麻醉后置于1.5ml EP管中;加入50uL含proteinase K(質(zhì)量濃度20mg/mL)的Squishing Buffer(SB)緩沖液后用研磨棒將果蠅充分研磨,如沾壁可稍離心;置37℃金屬浴孵育30min,轉(zhuǎn)入95℃金屬浴孵育2min;10000r/min離心3min,取上清液作為DNA模板。
(2)常規(guī)方法二:用剪刀將100uL移液器槍頭的尖部剪去少許后,用移液器吸取50uL質(zhì)量分數(shù)為5%的Chelex-100溶液(預(yù)先搖勻)到EP管中,另加入2uL的proteinase K(質(zhì)量濃度20mg/mL);取兩只麻醉后的果蠅于EP管中,用研磨棒充分研磨,渦旋振蕩30s,于1000r/min離心1min混勻;將EP管置于56℃恒溫水浴鍋中水浴6h,再轉(zhuǎn)入95℃水浴3min,14000r/min離心3min,取上清液作為DNA模板。
(3)高效法:去兩只麻醉后的果蠅于1.5mL的EP管中,加入50uL NaOH堿裂解液(濃度100mmol/L,pH12),用研磨棒將果蠅充分研磨60s,使果蠅蟲體全部碾碎;將EP管放入干式恒溫中100℃孵育100min;之后加入50uL This-HCL(濃度40mmol/L)與原液充分混勻,經(jīng)10000r/min離心2min,取上清液作為DNA模板。
DNA質(zhì)量濃度及純度檢驗:三種提取方法各設(shè)二次重復(fù)實驗得到9份樣品,分別取1uL DNA使用超微量分光光度計測定DNA質(zhì)量濃度、A260/A280和A260/A230,比較三種方法提取的DNA質(zhì)量濃度以及雜質(zhì)情況。數(shù)據(jù)采用平均±標準差表示,并進行單因素方差分析,α=0.05。
PCR擴增:對提取的DNA的YAP序列進行PCR擴增。引物序列上游為TGAAACAGCAAGAACTGCTTC;下游為:CACCACTGCTCCCATTCA。PCR反應(yīng)體系20uL,其中,含DNA模板0.4uL,上下游引物各0.4uL(10umol/L),ddH2O 8.8uL,Taq Master Mix 10uL。PCR擴增程序:95℃預(yù)變形3min;95℃變形15s,56℃退火15s,72℃延伸30s,30個循環(huán);72℃再延伸2min,最后保持10℃。
PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測:取擴增后的9分PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,評價三種方法的基因組DNA的PCR擴增效率。樣品量8uL,DNA Marker 3uL,核酸染料為GelRed 3uL,電壓100V,電泳時間20min。通過凝膠成像儀成像。
實驗結(jié)果
1、DNA質(zhì)量濃度及純度檢測
統(tǒng)計DNA質(zhì)量濃度、、A260/A280、A260/A230、提取時長以及成本數(shù)據(jù)(結(jié)果如下表)。高效法和常規(guī)方法一對比的話,提取量十分接近,但濃度更高,重復(fù)實驗的方差小,提取效果也更好;高效法和常規(guī)方法二對比的話,常規(guī)方法二的DNA質(zhì)量濃度低并且數(shù)據(jù)的方差大,提取效果很不穩(wěn)定,和高效法相比差異明顯。
提取方法 | DNA質(zhì)量濃度(ng/uL) | A260/A280 | A260/A230 | 提取時長(min) | 實際成本(元) |
常規(guī)方法一 | 673.5±44.45 | 1.28±0.13 | 0.58±0.13 | 19.17±1.04 | 3.5 |
常規(guī)方法二 | 359.9±98.25 | 1.29±0.11 | 0.56±0.04 | 371.5±1.5 | 0.13 |
高效法 | 676.5±28.74 | 1.61±0.01 | 0.44±0.005 | 15.17±0.76 | 0.02 |
表1 三種方法的實驗數(shù)據(jù)
通過測定A260/A280判斷樣品中的蛋白質(zhì)污染情況,純度較高的DAN的A260/A280在1.6-1.8,低于此范圍說明蛋白質(zhì)含量超標,高于此范圍表明樣品中含有RNA。高效法提取樣品的A260/A280約為1.6,表明DNA純度較高,蛋白污染較小,且方差最小,重復(fù)性最好;另外兩種方法提取的樣品A260/A280均低于1.3,蛋白質(zhì)含量超標,說明蛋白質(zhì)被污染。
通過測定A260/A230值判斷樣品鹽離子干擾情況情況,若A260/A230小于2.0,表明有小分子和鹽類干擾。實驗結(jié)果表現(xiàn)是,三種方法提取的鹽離子都比較多。
圖1 三種提取方法A260/A280和A260/A230的顯著分析(ns表示無明顯差異,**表示P<0.01)
2、PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠檢測
對YAP基因片段進行PCR擴增,三種提取方法獲得的DNA擴增產(chǎn)物的電泳條帶都比較明亮且單一,在1000-1500bp(圖3).三種提取方法獲得的DNA樣品都滿足實驗需求。
M:DNA Marker;1-3:常規(guī)方法一提取DNA擴增產(chǎn)物;4-6:常規(guī)方法二提取DNA擴增產(chǎn)物;7-9:高效法提取DNA擴增產(chǎn)物
圖2 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳
總結(jié)
本文選用的三種方法提取果蠅DNA的質(zhì)量均滿足實驗要求,并且高效法提取的DNA濃度和純度要比常規(guī)方法質(zhì)量更高,方差更小。高效法對比常規(guī)的兩種方法,不因操作步驟少,提取時間更短,并且成本也極低,提取果蠅的DNA效果明顯,非常適合實驗和教學(xué)需求。使用高效法,能為后續(xù)的實驗設(shè)計奠定更好的基礎(chǔ),推動課程建設(shè)。
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